Hello，大家好，我是贫穷激发创造力的科研鳖，最近做了一批transwell,从预实验到染出还能看的东西着实费了一番心思，但是最后分析数据的时候常用的平台都没有什么好贴。万幸小鳖我斥巨资购买的VPN让我从油管里看到了希望，加上自己的改进，觉得还挺靠谱，分享给亲们~

一、首先安装image J + file-open

windows用户直接安，IOS的老铁们先安装个JAVA环境（从JAVA官网就能下来），再安装image J（从官网也能下来）。总的来说还是一劳永逸的，不算很麻烦，我们科研都做了还怕什么麻烦，使用方法不管哪个版本都差不多。打开图片这种老年人操作就不用介绍了吧……不好意思桌面有点乱……

二、将图片转换成黑白

如图所示，image-type-8-bit

三、调整阈值

image-adjust-threshold打开调整界面，把原图放在一边，边调节画圈的位置边看着原图，以防用力过猛或隔靴搔痒。上下两个数可以是0/128或28/76什么的，看起来细胞尽量都黑了，背景也比较白就差不多了，不用苛求两个数非得是多少。还要调到B&W，Dark background。都好了之后按apply,就可以关掉阈值界面了~

四、分割

上一张图所有接触的细胞还都是一片，这么计数肯定会少，所以这一步用watershed把连在一起的细胞分开。process-binary-watershed,细胞被分开了吧

五、分析数量

analyze-analyze particles打开分析窗口

我的重要创新点就是这个调整大小，从0.005开始算起，否则脏的背景也要被计算进去了（0.005也不是绝对的，可以适当调整，根据照片质量不同，我在计数的时候也用过0.008，0.01，0.015不等）。勾选show  outlines, display results，选好了之后点OK

六、结果展示

嗒哒~软件说这一张皂片有257个细胞，俺看它勾选的还挺准，就酱！

之后把数据写到Excel里去做统计就完工了~介于版面还有挺多地方我就再总结一下预实验里的种种艰辛

1、第一次是按照我师姐留下的protocol，那个岁月里的matrigel胶还是风华正茂的，1：20三个小时也就凝固了。到了我这代的时候胶已经风烛残年，第一次做这个实验整整5个小时这个胶还像果冻爽一样潇洒，并没有像果冻一样凝固，但是硬着头皮也做了。

解决方案：做一个1：5，1：7，1：10，1：15的梯度预实验，最终选定了1：8三个小时的包被为准。

2、染色的时候传说中要用棉签擦拭，作为一个科研鳖我深以为既然穿过去了肯定就不会掉了，之后拿着棉签把白花花的细胞擦了个干净……

解决方案：后来才知道轻轻擦就是把棉签头抓成鸡窝，在用那种和没擦一样的力度来个假动作。之前该掉下来的细胞也在三次冲洗之下不复存在了。

3、结晶紫也是我师姐那代的结晶紫，瓶子上没写浓度，天真的我就直接拿来用了，直到有一天我师姐告诉我那个是原液……原液……原液……

解决方案：来历不是特别清楚的东西用之前最好要查好说明书，上官网输入货号，比如我那瓶上古结晶紫就应该用PBS稀释10倍，染色15分钟，自来水冲洗干净。

4、我以为的包被3小时就是3小时后处理细胞吗？拿衣服！作为有n组细胞m个小室的一次实验难道还妄想在瞬间完成洗，消化，离心，重悬，计数，计算，重悬，种板这么多操作吗？第一次正式试验，当我把细胞处理完已经包被了4小时了，胶干大劲了。

解决方案：提前算好操作时间，在包被后3小时精准地把细胞加进去。

5、师兄说把小室放到载玻片上，倒置显微镜拍照。结果怎么也拍不好，同一个视野不管怎么调焦都是一部分清楚一部分模糊。后来我发现是那个膜会像脚一样站着，把整个东西支起来了，而且不平。

解决方案：剪膜太麻烦，是时候发挥俺聪明才智了，我把小室塞到了复苏细胞的浮漂上，平与不平，尽在掌握